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PCR실험결과와고찰레

 

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우리조의 PCR 결과 Band는 326bp에서 형성되어야 하지만 220bp 정도의 범위에서 결과를 얻을 수 있었다. 아마도 이는 우리가 원하는 DNA의 부위가 없어서 목적하는 DNA의 증폭이 일어나지 않은 것으로 생각된다. PCR에서는 몇 가지 중요한 실험적 과정들이 있는데, 먼저 Tm값의 설정을 정확히 해야한다. Tm 값은 DNA가 녹게되는 온도를 말하는 것으로 DNA의 염기의 비에 의해 결정되어 진다. annealing과정에서 온도를 충분히 높여주지 못하면 원하는 부위의 단일 밴드가닥을 얻기가 어렵다. 또 Mg2+ ion의 농도는 PCR의 양과 특이성을 결정짖는데 아주 중요한 역할을 한다. Mg2+ ion의 농도를 너무 높게 잡게되면 주형의 DNA와 primer간의 결합이 잘못 짝지어져 PCR의 반응 특이성을 얻기가 힘들어 진다. 반대로 Mg2+ ion의 농도를 낮게 넣어주면 Taq polymerase의 반응이 제대로 활성화되지 못한다.

 

 

 

※ Tm 값

짝지어진 염기들의 수소결합이 파열되면 DNA 나선의 두 가닥들은 쉽게 분리된다. 이것은 DNA의 용액을 가열하거나, 염기들을 이온화시키기 위해서 산 또는 알칼리를 가함으로써 이루어진다. 이중나선의 풀림을 녹음(melting)이라고 부른다. 왜냐하면 이런 녹음은 일정한 온도에서 갑작스럽게 일어나기 때문이다. 녹는온도(Tm, melting temperature)는 DNA 나선 구조의 반이 없어질 때의 온도를 말한다. 변이가 갑작스럽게 일어난다는 것은 DNA 이중나선은 서로 보강하는 많은 결합들에 의해서 결합된 협동성이 매우 큰 구조임을 가리킨다.

 

 

※ Mg2+ 농도가 미치는 영향

PCR의 양과 특이성을 결정하는 또 하나의 중요한 변수가 Mg2+의 농도이다. Mg2+ ion의 농도가 높아지면 DNA double helix를 안정시켜서 denaturation이 잘 일어나지 않아 양이 적어지기도 하고, mispriming된 부분의 stability를 증가시켜 non-specific products가 많이 나오게 된다. 반면 농도가 너무 낮으면 Taq polymerase가 작용하기 위한 co-factor의 역할을 제대로 수행하지 못해서 DNA extention이 제대로 일어나지 못하게 된다.(이 최소값은 0.5μM로 알려져 있다) 또한 Mg ion은 dNTPs에 chelation이 되어서 농도가 낮아짐을 역시 고려해야 한다. 실제 high GC region에 대한 PCR을 수행할 때는 이 Mg ion의 optimal value window가 매우 좁다. 즉, 적절한 양과 특이성을 나타낼 수 있는 optimal concentration의 범위가 작으므로 꼭 optimization을 시행해야 한다는 것이다.

 

 

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